羥基酪醇 (HT) 是從橄欖油中提取的一種天然的多酚類化合物，具有多種生物和藥理活性。羥基酪醇的抗氧化性和對自由基的清除能力比其它一些合成的或天然的化合物都要高，能夠有效清除內源性和外源性自由基和氧化物[1，2]，是一種有效的抗氧化劑。本研究通過體外培養 HEK-293 細胞，以 H2O2 誘導 HEK-293 細胞損傷模型，研究羥基酪醇 對氧化性損傷的保護作用。
1、試驗方法
1. 1 細胞內 ROS 測定
參考文獻 [3] 方法，收集細胞，加入 12. 5、25、50 μM 的羥基酪醇 進行預處理1h，再加入20μM 的 H2O2 作用1h，同時設空白對照組。用熒光比色計測定熒光強度，激發波長 485 nm、發射波長 550 nm、狹縫 4 nm。
1. 2 細胞內谷光甘肽 ( GSH) 含量的測定
參照文獻 [4] 方法，收集細胞，加入 12. 5、25、50 μM 的羥基酪醇 進行預處理1h，再加入20μM 的 H2O2 作用1h，同時設空白對照組。用熒光比色計測定熒光強度，激發波長 350 nm、發射波長 420 nm、狹縫 4nm。
1. 3細胞內 8-羥基脫氧鳥苷 ( 8-OHdG) 免疫組化分析
參照 Yarborough 等的方法[5]略加改進。培養細胞，將細胞接種于底部放有蓋玻片的 24 孔板上，37℃ 培養24 h。加入 12. 5、25、50 μM 的羥基酪醇，再加入 20μM 的H2O2，設立空白對照組。取出蓋玻片干燥后用冷丙酮固定。加入 Triton X-100、封閉、一抗、二抗、染色、顯微鏡下閱片。應用 Image-pro plus 4. 5. 1 圖象分析系統進行定量圖象分析，隨機選擇 50 個細胞，用測得的光密度值 ( 數值放大 1 000 倍) 表示 8-OHdG 陽性表達的相對強弱。
1. 4 統計分析
采用 SPSS 11. 5 對結果進行分析，數據以均數 ± 標準差表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，兩組均數比較采用 t 檢驗，顯著性水準為 0. 05 和 0. 01。3 結果與分析
2. 1HT 對 H2O2所致 ROS 生成增多的影響
與空白對照組比較，H2O2 損傷模型組細胞內 ROS水平明顯升高 ( P < 0. 05) 。在羥基酪醇1 ( 12. 5μM) 、HT2( 25μM) 、HT3 ( 50μM) 各預處理組細胞內，與 H2O2損傷模型組比較，預處理組羥基酪醇3 ( 50μM) 細胞內的 ROS水平明顯降低，并呈劑量依賴關系 ( P < 0. 05) ，表明抗氧化劑羥基酪醇 能抑制細胞內 ROS 的生成 ( 圖 1) 。
2. 2羥基酪醇對 H2O2所致 HEK-293 細胞 GSH 下降的影響
與空白對照組比較，H2O2 損傷模型組細胞內 GSH水平明顯下降 ( P < 0. 01) 。與 H2O2 損傷模型組比較，HT 預 處 理 組羥基酪醇1 ( 12. 5μM) 、HT2 ( 25μM) 、HT3( 50μM) 細胞內的 GSH 水平升高，并呈劑量依賴關系( P < 0. 05) ( 圖 2) 。
2. 3羥基酪醇對 H2O2所致 HEK-293 細胞內 8-OHdG 表達水平的影響
在顯微鏡下觀察，細胞內 8-OHdG 陽性物質呈棕黃色，主要集中在細胞核中。與空白對照組比較，H2O2損傷模型組細胞內細胞核的著色明顯增加。在預處理組HT1 ( 12. 5μM) 、HT2 ( 25μM) 、HT3 ( 50μM) 細胞內，隨著羥基酪醇劑量的增加細胞核的著色減輕。經定量分析，預處理組隨著羥基酪醇 濃度的增加，HEK-293 細胞核的平均光密度值降低，與損傷模型組比較，差別具有顯著性差異 ( P < 0. 05) ( 圖 3) 。
3、 討論
抗氧化作用是指抗氧化活性物質通過抑制自由基的產生、清除自由基來抑制自由基參與的過氧化反應[6]。一些外源性化合物進入體內后，活化機體細胞中的氧而產生 ROS，其對大多數細胞都具有毒性作用。GSH 為細胞內分布最廣的非蛋白巰基化合物，是非酶性抗氧化劑，能夠清除氧自由基。GSH 最重要的功能基團巰基( -SH) 與 ROS 直接結合，緩沖 ROS 對生物膜、酶受體等的損傷[7]，對 DNA、蛋白質、脂類等生物分子的氧化損傷具有重要的保護作用。
抗氧化物質主要通過抑制 ROS 和過氧化氫的產生，減少DNA的氧化損傷。以往的研究表明，羥基酪醇對 DNA氧化性損傷具有很強的保護作用[8，9]。在本研究中，提前加入不同劑量 ( 12. 5—50μM) 的抗氧化劑羥基酪醇，能夠降低 ROS 的升高，并恢復 GSH 水平的降低。引起 DNA 損傷的機制有很多，其中最重要的是氧化性損傷。在眾多 DNA 氧化損傷產物中，以 8-OHdG 最為常見，它是 ROS 破壞 DNA，引起 G: C 到 T: A 突變的產物[10]，是評價 DNA 氧化損傷的敏感指標和生物標志物[11，12]。本研究結果表明，抗氧化劑羥基酪醇可降低HEK-293細胞內8-OHdG 表達水平。
綜上所述，羥基酪醇具有抗氧化作用和抑制自由基的功能，在 H2O2 誘發的細胞損傷中，能夠有效阻止 HEK-293 細胞 DNA 的氧化性損傷，起到重要的保護作用。
參考文獻
[1] Visioli F，Bellomo G，Galli C. Free radical-scavenging prop-erties of olive oil polyphenols [J] . Biochem Biophys ResCommun，1998，247: 60 – 64.
[2]Auroma OI，Delane M，Jenner A，et al. Effects of hydroxyty-rosol found in extra virgin olive oil on oxidative DNA damageand on low-density lipoprotein oxidation [J] . Agric. FoodChem，1998，46: 5158-5187.
[3]Sohn JH，Han KL，Lee SH，et al. Protective effects of pandu-ratin A against oxidative damage of tert-butylhydroperoxide inhuman HepG2 cells [J] . Biol. Pharm. Bull，2005，28:1083-1086.
[4] LeBel CP，Ischiropoulos H，Bondy SC. Evaluation of theprobe 2'，7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive ox-ygen species formation and oxidative stress [J] . Chem.Res. Toxicol，1992，5: 227-231.
[5]Yarborough A，Zhang YJ，Hsu TM，et al. Immunoperoxidase detection of 8-hydroxydeoxyguanosine in aflatoxin B1-treatedrat liver and human oral mucosal cells [J] . Cancer Res，1996，56: 683-688.
[6]喬鳳云，陳欣，余柳青 . 抗氧化因子與天然抗氧化劑的研究綜述 [J] . 科技通報，2006，22 ( 3) : 332-336.
[7]Sen CK. Redox signaling and the emerging therapeutic poten-tial of thiol antioxidants [J] . Biochem. Pharmacol，1998，55 ( 11) : 1747-1758.
[8]Zhang XM，Jiang LP，Geng CY，et al. Inhibition of Sudan I genotoxicity in human liver-derived HepG2 cells by the an-tioxidant hydroxytyrosol [J] . Free Radic Res，2008a，42:189-195.
[9]Zhang XM，Jiang LP，Geng CY，et al. Inhibition of acrylam-ide genotoxicity in human liver-derived HepG2 cells by theantioxidant hydroxytyrosol [J] . Chem Biol Interact，2008b，176: 173-178.
[10]Breton CV，Kile ML，Catalano PJ，et al. GSTM1 and APE1genotypes affect arsenic-induced oxidative stress: a repeated measures study [J] . Environ Health，2007，69 ( 1) : 39.
[11]Kasai H. Analysis of a form of oxidative DNA damage，8-hy-droxy-2'-deoxyguanosine，as a marker of cellular oxidativestress during carcinogenesis [J] . Mutat Res，1997，387( 3) : 147-163.
[12]Henle ES，Linn S. Formation，prevention and repair of DNA damage by iron /hydrogen peroxide [J] . Biol. Chem，1997，272 ( 31) : 19095-19098.
