羥基酪醇對自由基誘導的氧化性損傷的抑制作用

　　自由基產生于細胞呼吸和代謝過程中，是機體正常代謝產物，在體內有很強的氧化反應能力，易損害 DNA、蛋白質、脂質和線粒體，從而引起機體的損傷。自由基誘導的氧化性損傷與許多慢性疾病，如癌癥、心腦血管疾病、神經退行性疾病和細胞衰老等有關[1]。為了緩解自由基對人體的危害，許多天然抗氧化劑如維生素 E (α-生育酚)、白藜蘆醇、β-胡蘿卜素等被用于自由基的清除。因此，探索一些能夠切斷過氧化鏈式反應的抗氧化劑來抑制機體的自由基損傷已成為一種必要的趨勢。

　　和一些其他西方國家相比，地中海周邊國家的人們患癌癥和心腦血管疾病的幾率要低很多，而這就要歸功于著名的“地中海飲食”[3]。由于地中海飲食帶來了諸多益處，從而使其被廣泛地關注。典型的地中海飲食包括：小麥、橄欖油和葡萄[4]。大量研究表明葡萄中的活性成分白藜蘆醇(resveratrol)及其它多酚類化合物具有顯著的生物活性。而羥基酪醇(hydroxytyrosol，如圖 1)作為橄欖油中的主要活性成分也正日益引起大家的關注[5]。羥基酪醇大量存在于橄欖的果實和枝葉中，是橄欖油中一種重要的天然多酚類化合物。多方面研究表明，羥基酪醇具有非常好的生物活性，尤其在抗氧化方面有著顯著地作用。

　　DPPH 自由基和 ABTS.+自由基均是很穩定的自由基，常被用來檢測某種抗氧化劑清除自由基的能力。水溶性的偶氮化合物 2,2’-偶氮二(2-瞇基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH) 在生理溫度下通過熱分解而產生自由基，這些自由基能夠進攻蛋白質或脂類引發過氧化反應并最終導致氧化損傷。紅細胞(RBC)膜富含不飽和脂肪酸, 這些不飽和脂肪酸對自由基誘導的過氧化反應非常敏感，可使紅細胞溶血[6]。由于 AAPH 產生自由基的速率很容易控制和測量, 因此利用 AAPH 誘發紅細胞溶血能夠為進行自由基引發的膜損傷提供一個很好的研究方法[7]。除此之外，丙二醛(malonaldehyde, MDA)作為脂質過氧化的產物，也是一個判斷氧化損傷程度的重要標志物[8]。本文先檢測 羥基酪醇 清除 DPPH 和 ABTS.+ 兩種自由基的能力，然后檢測 羥基酪醇對 AAPH 誘導的紅細胞溶血以及紅細胞膜的氧化性損傷的保護作用，從而來證實羥基酪醇的抗氧化作用。

　　1. 實驗方法

　　1.1自由基清除實驗

　　DPPH 自由基的清除實驗[10]：先將不同濃度的 羥基酪醇 和 DPPH 溶液混和，羥基酪醇 的反應終濃度分別為 10、20、30、40、50 μM，DPPH 在體系中的濃度為 5×10-5 M。混勻后避光放置 30min，直至其吸光度值穩定。最后用紫外分光光度計測定反應液在 517 nm 處的吸光度。清除率% = ( Ac ? As) / Ac× 100%。As 和 Ac分別代表藥物作用組和對照組，白藜蘆醇為陽性對照。

　　ABTS.+自由基的清除實驗[11]：先將不同濃度的羥基酪醇和ABTS.+溶液混和，羥基酪醇的反應終濃度分別為 1、3、5、10、20 μM，ABTS.+在體系中的濃度約為 140 mM。混勻后避光放置 30min，直至其吸光度值穩定。最后用紫外分光光度計測定反應液在 734 nm 處的吸光度。清除率% = ( Ac ? As) / Ac× 100%. As 和 Ac分別代表藥物作用組和對照組，白藜蘆醇為陽性對照。

　　1.2 紅細胞溶血實驗

　　紅細胞的處理：人血紅細胞來自甘肅省蘭州市紅十字會血液中心。先取出 10 mL 的紅細胞，向其加 10 mL 的 0.15 M 的 NaCl 溶液，搖勻，2000 r/min 的轉速離心，不斷重復，直至離心后上清基本澄清。最后，吸掉上清，用 0.15 M 的 NaCl 溶液將紅細胞稀釋 10 倍，即紅細胞的濃度為 10 %。

　　溶血實驗[12]：用 pH=7.4 的 PBS 將紅細胞配成濃度為 5 %的紅細胞懸浮液，于 37℃溫育5 min，然后加入適量的 AAPH 水溶液引發溶血，溫育期間反應混合液輕輕搖動。在 30 min或 60 min 的時間間隔后先離心，再取出 100 μL 反應液, 用 900 μL 0.15 mol/L NaCl 稀釋, 混勻后取上層清液在酶標儀上測其在 540 nm 處吸光值 A1;同樣地取出適量的反應混合液，用蒸餾水稀釋使紅細胞完全溶血，同樣條件下離心后在 540 nm 處測其吸光值 A2，百分溶血度等于(A1 / A2 )×100。在抗氧化實驗中抗氧化劑 羥基酪醇 在 AAPH 加人以前先加人并且溫育。

　　1.3 TBARS 法檢測 MDA

　　紅細胞膜的制備：首先用 10 倍體積 pH=7.4 的 PBS 緩沖溶液將紅細胞重復洗滌三次，每次離心分離后小心除去上清液及暗黃色沉淀表層。然后用 30 倍體積預冷的 5 mmol/L 低滲磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.6)使紅細胞完全溶血，離心分離并洗滌后得到白色的紅細胞膜。紅細胞膜中的蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定。

　　TBARS 實驗[13]：將紅細胞膜懸浮在 pH=7.4 的 PBS 中，并恒溫在 37℃，然后向紅細胞膜中加抗氧化劑和 AAPH。隔上約10 min取出100 μL 反應液，加入250 μL溶液 A，于振蕩器上混勻，置于90℃加熱器30 min，待冷卻后，取上清液在分光光度計上測 532 nm 處吸光度。用10 nmol/ml 四乙氧基丙烷作為標準物。

　　1.4 蛋白氧化的測定

　　將 BSA 作為蛋白氧化的模型[14]。損傷模型反應體系包括：0.18mg/ml 的 BSA，0～50mM的 AAPH，二者在 37℃水浴中作用 1 h 后，在反應混合物中加含有 0.1 %B羥基酪醇 的 4×LoadingBuffer(B羥基酪醇 用于阻止過氧自由基的進一步形成)，100℃煮沸 5min 后，在 12 %的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳 3 h。凝膠在 0.05%的考馬斯亮藍 R-250 中染色，然后脫色拍照。在抗氧化實驗中抗氧化劑 羥基酪醇 與AAPH 一起加入反應體系37℃溫育。

　　2. 結果與討論

　　2.1 羥基酪醇 對 DPPH 和 ABTS.+兩種自由基的清除能力

　　DPPH 自由基 (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一種穩定的以氮為中心的質子自由基，乙醇溶液呈紫色，在 517 nm 處有強吸收峰。如圖 2A 所示，隨著 羥基酪醇 濃度的增大，清除 DPPH自由基的能力越強，當 羥基酪醇 的濃度為 40 μM 時，清除率可達 90%。結果同樣表明，隨著白藜蘆醇(Res)濃度的增大，清除 DPPH 自由基的能力也越強，但 Res 的清除效果遠不及 羥基酪醇。ABTS 在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的 ABTS.+，在 734 nm 處有吸收，當有抗氧化物存在時吸收會減弱。如圖 2B 所示，羥基酪醇 對 ABTS.+有一定的清除能力。隨著 羥基酪醇 濃度的增大，清除 ABTS.+自由基的能力越強，具有較好的濃度依賴關系當 羥基酪醇 的濃度為 20 μM 時，清除率可達 90%。同樣，隨著 Res 濃度的增大，清除 ABTS.+自由基的能力也越強，雖然 羥基酪醇的清除效果不及 Res，但其效果也很好。

　　2.2 羥基酪醇 對 AAPH 誘導的紅細胞溶血的抑制作用

　　AAPH 在紅細胞的水分散溶液中經熱分解可引發產生自由基 (R·)，它可以進攻紅細胞膜中的不飽和脂肪酸 (LH)，從而引發脂質過氧化((1)~(4)式)。在37℃的水分散溶液中AAPH 的引發速率是 1.3×10-6 [AAPH] /s[15]。由于脂質過氧化是一個自由基鏈式反應，一個自由基能夠引發多達 20 個鏈增長反應[15]，因此紅細胞膜會被迅速破壞而導致溶血。

　　圖 3 為在 37℃水浴中 AAPH 誘導的紅細胞溶血。3f 為不加 AAPH 的情況下，可以看出紅細胞是穩定的，在 4 h 之內基本沒有溶血發生。3a 為加入 AAPH 后，經過一定的抑制期后，紅細胞快速溶血，在 2 h 內溶血達到一個平臺。這個抑制期應該是由紅細胞本身所含有的生物抗氧化劑，如維生素 E 和泛氫醒-10 所造成的[16]，因為在膠束模擬體系中加入AAPH時并沒有觀察到抑制期[17]。從圖 3c、3d、3e 可以看出，向反應體系中加入 羥基酪醇 后溶血的速率減慢，減慢的速度隨著 羥基酪醇 濃度的增加而升高。3b 為加入 Res 后的溶血曲線，可以看出，Res 有一定的抗溶血作用，但效果不及 羥基酪醇。總體結果表明，羥基酪醇 擁有相當優異的抗 AAPH誘發的紅細胞溶血作用，具有很好的濃度依賴關系，并且效果遠優于陽性藥物 Res。

　　圖 3 37℃水浴中 AAPH 誘導的 5%人血紅細胞在 0.15 mol/L PBS (pH=7.4)中的溶血曲線。

　　2.3 羥基酪醇 對 AAPH 誘導的紅細胞膜過氧化的抑制作用

　　當紅細胞膜與 AAPH 作用時，膜上的脂質、蛋白質會被 AAPH 熱分解產生的自由基氧化破壞，MDA 是膜遭氧化后的產物，因此檢測 MDA 的生成量是一種有效地判斷氧化損傷程度的方法。本次實驗采用硫代巴比妥酸反應物法(TBARS)，即硫代巴比妥酸與 MDA作用生成一種粉紅色產物，此化合物在 532 nm 處有最大吸收。如圖 4a，為不加抗氧化劑只加AAPH 的情況下，可以看出 TBARS 值升高的比較快。從圖 3b、3d、3e 可以看出,向反應體系中加入 羥基酪醇 后 TBARS 值升高的速率減慢，減慢的速度隨著 羥基酪醇 濃度的增加而升高。3b 為加入 Res 后的溶血曲線，可以看出，Res 有一定的抗氧化作用，但效果不及 羥基酪醇。

　　圖 4 37℃水浴 AAPH 誘導的紅細胞膜在 0.15 mol/L PBS (pH=7.4)中的溶血曲線。

　　2.4 羥基酪醇 對 AAPH 誘導的 BSA 氧化性損傷的保護作用

　　從圖 5A 我們可以看出，BSA 與 AAPH 在 37℃水浴中作用 1 h 后，用 SDS-PAGE 電泳觀察到，隨著 AAPH 濃度的增加 BSA 的條帶亮度逐漸變暗，即 BSA 逐漸降解。如圖 5B，當向體系加入不同濃度的 羥基酪醇 后，可以看出，隨著 羥基酪醇 濃度的逐漸增加，BSA 的降解會被抑制，并有一定的濃度依賴性。根據條帶的濃度可以看出，相同濃度下(20 μM)，羥基酪醇 對 AAPH誘導的 BSA 氧化性損傷的保護作用要優于 Res。

　　圖 5 SDS-PAGE 檢測 羥基酪醇 對 AAPH 誘導的 BSA 氧化性損傷的保護。

　　由以上所有結果可以得出，羥基酪醇 在清除自由基方面有非常好的效果。和 Res 相比較，羥基酪醇 清除 ABTS.+自由基的能力弱于 Res，但清除 DPPH 自由基的能力優于 Res，這可能與抗氧化劑和自由基作用的機制有關。抗氧化劑使自由基失活主要基于兩種機制：電子轉移(ET)和氫質子轉移(HAT)。在實驗體系中，ET 與 HAT 可以同時發生，主反應機制由抗氧化劑的結構、性質、溶解性、分配系數、溶劑系統決定。HAT 通常快速，在分秒內就能完成;ET通常較慢，完成反應需要較長時間[18]。ABTS.+自由基由強氧化劑與 ABTS 鹽反應產生，DPPH則是一類較穩定的自由基[19]。ABTS+·的氧化還原電勢為 0.68V[20]，只要化合物的氧化還原電勢低于 0.68V，就能將 ABTS.+還原，導致體系綠色減退。

　　同時，ABTS.+又是一類可以通過 HAT 機制導致體系綠色減退的自由基。和 羥基酪醇 相比較，Res 結構上的酚羥基多一些，所以，Res 是一種更好的供氫抗氧化劑，使其在清除 ABTS.+自由基時效果要優于羥基酪醇。DPPH也并非是純粹的 ET 反應，在反應體系中，也會伴隨 HAT 機制，決定反應的主要因素是空間位阻效應，空間位阻大的抗氧化劑與 DPPH 較難反應，反應機制可能與空間位阻小的抗氧化劑不同，反應達到平衡的時間也較長[18]，因而，在清除 DPPH 自由基時空間位阻小的 羥基酪醇要優于空間位阻大的 Res。

　　氧化應激(Oxidative stress)是指生物體內 ROS 或者活性氮物種 (Reactive nitrogenspecies, RNS)的生成超出了機體對他們的清除能力，從而對生物體造成氧化性損傷。已有很多證據支持氧化應激與多種疾病如腫瘤、炎癥、衰老、神經退行性疾病、心腦血管疾病等有著密切關系[21]。對抗氧化應激的有效途徑之一就是補充各類抗氧化劑。由于羥基酪醇具有優越的抗氧化性能，其抗氧化活性有可能是其抗炎活性、抗腫瘤活性以及抗心腦血管疾病等功能的分子基礎。

　　羥基酪醇的藥理作用已不斷被證實，而其作用機理也逐漸被發掘。羥基酪醇具有鄰二羥基的結構，通常具有這一結構的化合物都具有較高的抗氧化活性[22]。這是由于：1)苯環上羥基處在鄰位時，可以增加羥基上的電子云密度，降低 O-H 鍵能，使得酚羥基上奪氫反應容易發生;2)苯環上羥基處在鄰位時，可以使其發生奪氫反應后生成的酚氧自由基的單電子離域到整個體系，同時可以被進一步氧化生成鄰醌或對醌(圖 6);3)具有鄰二酚羥基的化合物的酚羥基氫被自由基奪取后可與其鄰位羥基形成分子內氫鍵，這同樣可以穩定生成的自由基(圖 6)。

　　圖 6 具有鄰二羥基結構的 羥基酪醇 可能的抗氧化作用機制

　　3. 結論

　　羥基酪醇作為橄欖油里的一個主要活性物質，在清除自由基方面有卓越的作用，并且可以抑制自由基誘導的人血紅細胞的氧化性溶血、紅細胞膜的氧化損傷以及 BSA 氧化性損傷。正如姜黃素(curcumin)、白藜蘆醇一樣，它在抗炎、抗癌、抗心腦血管疾病以及抗氧化等方面的作用已逐漸被挖掘，羥基酪醇也是一種來源于食用植物的天然化合物，這對于羥基酪醇在食品添加劑、化妝品、保健食品和醫藥方面的開發和利用提供了良好的理論依據。

　　由于羥基酪醇結構簡單，因而對其開展化學修飾以及相關的化學生物學研究具有很大的潛力及可行性。通過研究羥基酪醇與各類可能靶點分子的作用，進而闡述其作用機制將會是今后認識羥基酪醇各類生物活性的重要手段，同時也將為基于羥基酪醇的化學結構修飾指明方向。我們期待能夠對羥基酪醇進行更為深入的生物活性機制研究以及發展出基于羥基酪醇結構的具有更好生物活性的小分子化合物，同時進一步開發出羥基酪醇和其衍生物更多應用價值。